免疫共沉淀 (Co-IP)浅见

一.原理:
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的protein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的protein A就能吸附抗原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其优点为:
(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;
(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;
(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为:
(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;
(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;
(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。
二.实验步骤及注意事项:
悬浮细胞:
准备工作:预冷PBS(加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂),Lysis(NP40) buffer,Washing buffer,RNase-free EP管(盖子紧些);
1. 离心收细胞(800rpm,10min)。(细胞数量大于1*107)
用预冷的PBS洗涤细胞两遍,(3000rcf,6min),最后一遍把上清倒掉,甩一下,用小一号枪吸去多余的PBS,留少许,用手把细胞团块弹匀;加500ul的裂解buffer,用手弹一下,震匀;(用枪吹匀即可)
2. 取剩冰的小容器(玻璃杯等),将EP管放入其中(有冰),放到摇床上90rpm/min以上摇30min;(摇床转速适当大点,以使液体摇晃起来);
3. 12000g 15min, 4℃,离心;
4. 用中号枪头小心取上清于另一新EP管中;
5. Pre-clear:加入protein-A/G beads 20ul,和1 ug normal rabbit IgG进行pre-clear;缠上封口膜; 4℃转盘上1h;(转速宜小)
6. 2000rpm/min 3mins离心,将上清小心吸取到另一新EP管中。取2ul 进行正常BCA蛋白定量。
7. 根据蛋白浓度,用wash buffer(含蛋白酶抑制剂)将蛋白浓度稀释到1ug/ul,取11ul作为INPUT(根据稀释倍数计算出是百分之几的INPUT),放-20℃备用。
8. 另外,将稀释好的蛋白平均分到两个EP管中,一个加目的抗体(1-2ug) ,另一管加同种的IgG (1-2ug) , 4℃转盘中过夜。
9. 第二天早上过来加proteinG-beads(20ul)/管,黄枪头尖剪开,4℃转盘中6h;(转速宜低)。
10. 2000rpm/min 离心3分钟,去上清,用400ul wash buffer(含蛋白酶抑制剂) 洗3遍,上下颠倒混匀(转盘上3min,转速稍快一点),同样方法离心去上清;去上清时注意:小心吸取上清,不要吸到珠子(先大枪头后小枪头);
11. 吸干上清后,加入20ul wash buffer 重悬beads,按wash buffer: 4Xloading : 1M DTT=20:8:3 制样;(上样缓冲液不宜太多,否则易稀释蛋白,造成蛋白浓度太低)
12. 加完之后vertex震动混匀,煮样5min(目的是煮掉蛋白与珠子的结合),离心机甩一下,转速不要太快 (小于3000rpm,将beads离心下来),吸取大约2/3的总体积上清上样电泳。
注:input 的蛋白浓度可以与抗体孵育的样品不一致,但每组样品间的浓度要一致。
lysis: 50 mM Tris-Hcl(PH7.6) 120mM Nacl 1mM EDTA 1% NP-40 wash: 20mM Tris-Hcl(PH7.6) 100mM Nacl
1mM EDTA
贴壁细胞:
准备工作:预冷PBS(加蛋白酶抑制剂和非加抑制剂),Lysis(NP40) buffer, Washing buffer, 细胞刮子(预冷),RNase-free EP管(盖子紧些);
1. 用预冷的PBS洗涤细胞两遍,最后一遍吸干PBS;
2. 加1ml/皿的PBS,用细胞刮子小心将细胞从皿中刮下,将悬液加入到1.5ml的EP (RNase-free)管中;(用胰酶消化,收细胞 (较好))(后改用细胞刮收细胞);
3. 3600-4000rpm/min 离心收细胞,把上清倒掉,甩一下,用小一号枪吸去多余的PBS,留少许,votex震一下,枪吹一下,混匀细胞;
4. 加40-80ul的裂解buffer,用手弹一下,震匀;(用手弹匀即可,适用于弱结合);
5. 取剩冰的小容器,将EP管放入其中(有冰),放到摇床上90rpm/min以上摇30mins;(摇床转速大点);
6. 12X1000g 15mins, 4℃,离心;
7. 用中号枪头小心取上清于另一新EP管中;
1) 留11ul做INPUT, 另取2ul正常蛋白定量;
2) 取出的上清稀释10倍,用加蛋白酶抑制剂的PBS稀释;(改为wash buffer) ;
3) 加入protei-G beads(也加IgG)进行pre-clear;根据蛋白浓度加一定量的beads,缠上封口膜;4℃转盘上1h;2000rpm/min(不能超过300g)3mins离心,
4) 将上清小心吸取到另一新EP管中,之后从刚才EP管中直接取10ul加入配好的BCA中定量; 半定量实验需要;
8. 将定量好的蛋白平均分到两个EP管中,一个加目的抗体,另一管加同种的IgG, 4℃转盘中过夜;(抗体用量:1-2ug)
9. 第二天早上过来加proteinG-beads(20ul)/管,黄枪头尖剪开,4℃转盘中4h;(时间根据自定)
10. 2000rpm/min 离心3分钟,去上清,用等体积(稀释10倍的pre-clear 的体积)wash buffer 洗3遍,上下颠倒混匀(转盘上3min,转速稍快一点),同样方法离心去上清;去上清时注意:小心吸取上清,不要吸到珠子(先大枪头后小枪头),同时两个样品留的上清要基本(目测)一样多;(后改为:吸干上清,按20:8:3 加loading buffer);
11. 用总体积 30ul 4Xloading buffer+DTT(PBS+loadingbuffer+DTT,上样缓冲液不宜太多,否则易稀释蛋白,造成蛋白浓度太低),加完之后轻轻用手弹一下,然后离心机甩一下(直接煮)。 煮样5mins(目的是煮掉蛋白与珠子的结合),离心机甩一下,转速不要太快(大约4000rpm/min—5000rpm/min),吸取大约2/3的总体积上样电泳。
lysis: 50 mM Tris-Hcl(PH7.6)
120mM NaCl
1mM EDTA
1% NP-40 wash:
20mM Tris-Hcl(PH7.6 )
100mM Nacl
1mM EDTA 三.注意的问题:
(1)细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互
作用,多采用非离子变性剂(NP40 或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通
过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的 cocktailer。
(2)使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用。
(3)使用对照抗体:单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗;兔多克隆抗体:正常兔IgG 。
四.在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:
(1)确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;
(2)要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;
(3)确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定;
(4)最好使用新鲜细胞或组织做该实验,避免冻融过程,以免破坏蛋白间相互作用。

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